在生物藥研發(fā)中，抗體的電荷異構(gòu)體直接影響藥物療效與安全性。離子交換色譜（IEX）操作繁瑣且分辨率有限，傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）常因高濃度緩沖液與ESI不兼容，導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏差?！禘lectrophoresis》期刊發(fā)布的一項(xiàng)研究利用MauriceFlex進(jìn)行電荷異構(gòu)體的快速分離，并進(jìn)行質(zhì)譜分析，為這一難題提供了高效的解決方案。

研究以單克隆抗體Matuzumab為測試對象，通過MauriceFlex儀器實(shí)現(xiàn)了電荷異構(gòu)體的快速分離和離線質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示，MauriceFlex不僅能夠高效地分離電荷異構(gòu)體，還能與質(zhì)譜無縫對接，提供高分辨率的分析結(jié)果。這種方法不僅克服了傳統(tǒng)方法的局限性，還顯著提高了分析的準(zhǔn)確性和可靠性，為單克隆抗體的深層表征提供了全新的視角。

01. 研究方法

(1) 毛細(xì)管等電聚焦電泳（icIEF）：使用MauriceFlex儀器進(jìn)行icIEF分析，分為分析型和制備型（餾分收集）兩種模式。分析型icIEF建立基礎(chǔ)分離條件，制備型icIEF通過增加樣品濃度和添加精氨酸優(yōu)化餾分收集，通過化學(xué)遷移技術(shù)將電荷異構(gòu)體餾分收集至96孔板。

(2) 熒光檢測：通過熒光測量確定96孔板中含有蛋白質(zhì)的孔位。

(3) 質(zhì)譜分析（MS）：使用高分辨率質(zhì)譜儀對收集的電荷異構(gòu)體進(jìn)行分析，解析其結(jié)構(gòu)特征。

(1) 方法適用性驗(yàn)證

使用MauriceFlex儀器僅用1天完成了從分析型cIEF轉(zhuǎn)化為制備型餾分收集的方法開發(fā)，并在2.5小時(shí)內(nèi)完成了高純度電荷異構(gòu)體餾分收集。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分析型與制備型cIEF的峰數(shù)量相同，方法轉(zhuǎn)化后分離效果良好，表明從分析到制備的方法轉(zhuǎn)換可靠，為后續(xù)質(zhì)譜分析提供了可靠的樣本。

圖1 Matuzumab的分析型icIEF(上)與制備型icIEF餾分收集電泳圖(下)對比

(2) 方法穩(wěn)定性評估

為了評估餾分收集方法的穩(wěn)定性，將Matuzumab樣品在制備型icIEF模式下獨(dú)立收集三次（Run1- Run 3），通過分析型icIEF對每次收集的餾分進(jìn)行驗(yàn)證（圖2），結(jié)果顯示各電荷異構(gòu)體在不同分離批次中的峰形和位置高度一致，表明MauriceFlex制備型icIEF（餾分收集）具有良好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。盡管三次實(shí)驗(yàn)餾分在96孔板中分布位置存在微小偏移（1-2孔），但通過分析型icIEF驗(yàn)證可輕松匹配對應(yīng)餾分，驗(yàn)證了餾分收集過程的穩(wěn)定性。

圖2 Matuzumab樣品三次餾分收集后的分析型icIEF結(jié)果

(3) 質(zhì)譜分析

使用高分辨率質(zhì)譜儀檢測未分離的Matuzumab抗體和經(jīng)過MauriceFlex分離的餾分，發(fā)現(xiàn)未分離的樣品質(zhì)譜信號重疊嚴(yán)重，而經(jīng)MauriceFlex分離的餾分在質(zhì)譜圖上顯示出更清晰和特異的峰，表明MauriceFlex有效地富集了特定的電荷異構(gòu)體。通過質(zhì)譜成功鑒定了包括C末端賴氨酸異構(gòu)體（K2、K1、K0）糖基化異構(gòu)體（FA2和A2G1），這些發(fā)現(xiàn)對于理解單克隆抗體的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。研究還發(fā)現(xiàn)了一些未報(bào)道過的酸性異構(gòu)體，表明MauriceFlex餾分收集和質(zhì)譜的分析方法能有效揭示復(fù)雜電荷異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)信息。

圖3 非分餾樣品（上）與icIEF餾分（下）的質(zhì)譜對比

作者以Matuzumab為測試對象，成功開發(fā)了分析型icIEF方法，并快速轉(zhuǎn)化為制備型icIEF方法，2.5小時(shí)內(nèi)完成高純度電荷異構(gòu)體餾分收集，質(zhì)譜分析則清晰揭示了包括C末端賴氨酸異構(gòu)體、糖基化異構(gòu)體在內(nèi)的多種電荷異構(gòu)體，甚至發(fā)現(xiàn)了一些未報(bào)道過的酸性物質(zhì)。MauriceFlex+MS聯(lián)用方法不僅克服了傳統(tǒng)方法的局限性，還顯著提高了分析的分辨率和準(zhǔn)確性，為單克隆抗體的深層表征提供了全新的視角。

MauriceFlex全自動(dòng)毛細(xì)管電泳分析與組分收集系統(tǒng)

* 參考文獻(xiàn)：Wittmann, Antonia et al. Evaluation of a cIEF Fractionation Workflow for Offline MS Analysis of Charge Variants of the Monoclonal Antibody Matuzumab. Electrophoresis. 2025;46(3-4):240-249.

* 本文轉(zhuǎn)載自「ProteinSimple」微信公眾號